蛋白质折叠：从氨基酸序列到三维结构

打破一个常见误解#

折叠从来不是一道可以一锤定音的单一题目。肯·迪尔（Ken A. Dill）与詹姆斯·麦卡勒姆（James L. MacCallum）在2012年《科学》综述里把它拆成三问：序列如何编码结构，折叠为何能在生理时间内完成，以及能否从序列算出三维坐标。AlphaFold2主要推进的是第三问。前两问仍然是物理化学与细胞生物学的前线。

更准确的判断不是“会预测结构就等于理解了折叠”，而是“对许多球状蛋白，静态坐标已经可以计算；折叠路径、构象集合与错误折叠，仍须单独研究”。1972年诺贝尔化学奖授予克里斯蒂安·安芬森（Christian B. Anfinsen），表彰的是氨基酸序列与生物活性构象之间的联系。它不是一台可以穷举构象空间的机器。

莱文塔尔悖论#

1969年，赛勒斯·莱文塔尔（Cyrus Levinthal）提出了一个著名的思想实验：一个由100个氨基酸组成的蛋白质，如果每个氨基酸仅有两种构象状态，那么遍历所有可能的构象组合需要约2^100种尝试——即使每次尝试仅需1飞秒（10⁻¹⁵秒），也需要超过宇宙年龄的时间才能完成。然而，蛋白质在细胞内通常在微秒到秒的时间尺度内完成折叠。这就是莱文塔尔悖论：蛋白质并非随机搜索所有构象，而是沿着特定的能量漏斗（energy funnel）路径快速折叠到天然态。

这段论证的文本出处，是1969年在伊利诺伊大学阿勒顿庄园（Allerton House）举行的生物体系穆斯堡尔谱学会议文集。莱文塔尔的题目就叫《How to fold graciously》。他要说明的不是蛋白质“不该存在”，而是随机遍历在物理上不可能。折叠必须被能量地貌约束，而不能靠运气。

1997年，迪尔与陈煦荪（Hue Sun Chan）在《Nature Structural Biology》把这条出路写成漏斗图像。展开态处在漏斗口，构象极多、自由能高；天然态在漏斗底，构象少、自由能低。热运动沿着下坡把链条推向底部。多条微观路径可以并行，不必假设一条唯一的中间体序列。

漏斗图也解释了安芬森实验与莱文塔尔悖论为何并不互相取消。复性不必记住一条固定路线。只要天然态接近自由能最低点，而且地貌没有太多互相冲突的接触，链条就能在生理时间尺度内到达。

受挫（frustration）多的序列则容易被困在局部极小。它们在实验里表现为缓慢折叠、聚集，或对变性条件格外敏感。

折叠的物理机制#

蛋白质折叠由多种物理力驱动：

疏水效应是最主要的驱动力。在水环境中，非极性氨基酸侧链倾向于聚集在一起以减少与水的接触面积，这一过程在热力学上是有利的。疏水核心的形成通常是折叠的早期事件。

氢键稳定了二级结构（α螺旋和β折叠）。主链上的每个酰胺基团都可以形成氢键，这些局部相互作用为蛋白质提供了结构骨架。

范德华力、静电相互作用和二硫键进一步稳定了三级结构。分子伴侣（chaperone）蛋白如GroEL/GroES系统为折叠提供了受保护的环境，防止错误折叠和聚集。

安芬森的关键实验对象是牛胰核糖核酸酶 A（ribonuclease A）。这条链有124个氨基酸，含四对二硫键。他用高浓度尿素破坏非共价相互作用，用β-巯基乙醇还原二硫键，酶活性随之消失。

把变性剂除去之后，分子可以自发恢复催化活性。信息写在氨基酸序列里。这就是后来常说的热力学假说：生理条件下的天然构象，对应自由能最低的状态。

若在尿素仍在时先让硫氢基重新氧化，二硫键会配错，得到几乎没有活性的“打结”混合物。再在无尿素条件下加入微量巯基试剂，二硫键可以重排，活性重新出现。安芬森把这一过程写进1973年《科学》论文《Principles that govern the folding of protein chains》。

诺贝尔奖在前一年已经颁发。实验传统则上溯到1950年代他在美国国立卫生研究院（NIH）与迈克尔·塞拉（Michael Sela）、弗雷德里克·怀特（Frederick H. White）的工作。正确配对不是随机抽签。自由能把105种二硫键异构体里的绝大多数淘汰掉。

试管与细胞并不是同一套边界条件。核糖体上的新生链被拥挤的细胞质包围，错误接触的机会远高于稀溶液。

大肠杆菌的伴侣蛋白系统 GroEL/GroES 提供一个可开合的空腔：GroEL 是两个七聚体环叠成的桶，GroES 是盖子。底物进入空腔后，ATP 水解驱动盖子闭合与构象变化，为折叠提供一段受保护的时间窗口。乌尔里希·哈特尔（F. Ulrich Hartl）与阿瑟·霍里奇（Arthur L. Horwich）等人把这类机器写成细胞蛋白质稳态的核心部件。

伴侣蛋白并不改写安芬森的热力学结论。序列仍然决定哪一个构象是终点。它们改变的是到达终点的路径与速率，使新生链少走聚集这条死胡同。细胞里的折叠，是热力学加质量控制。

蛋白质化学关心的侧链相互作用，在这里变成可测量的热力学项。疏水效应、氢键、盐桥与二硫键不是一份可以任意勾选的菜单，而是同一条自由能账本上的不同栏目。改变溶剂、温度或氧化还原条件，账本就会改写。折叠与去折叠随之移动。

酶与生物催化把同一套物理约束写到功能上。活性位点的几何不是雕塑完成后的装饰，而是折叠到达天然态之后才出现的催化装置。突变若破坏疏水核心或二硫键配对，催化往往先于“外形变化”一起消失。

AlphaFold革命#

2020年，DeepMind的AlphaFold2在第14届CASP（蛋白质结构预测关键评估）竞赛中取得了惊人表现——其预测精度接近实验方法（X射线晶体学、冷冻电镜）的水平。这一成就被视为人工智能在科学领域的里程碑。

AlphaFold的核心创新包括：

• 注意力机制：利用多序列比对（MSA）中的共进化信息，识别在进化过程中协同突变的氨基酸对，这些对在空间上通常彼此接近。
• 端到端深度学习：直接从氨基酸序列预测三维坐标，而非传统的分步预测流程。
• 结构模块：使用不变点注意力（Invariant Point Attention）机制处理三维空间中的几何约束。

截至2022年，AlphaFold蛋白质结构数据库已包含超过2亿个预测结构，覆盖了几乎所有已知蛋白质序列。2024年，Demis Hassabis和John Jumper因这一贡献获得诺贝尔化学奖。

CASP由约翰·莫尔特（John Moult）等人主办。参赛者必须在实验结构公布前交出模型。2020年的第14届评估中，约翰·江珀（John Jumper）团队使许多靶标的精度逼近晶体学与冷冻电镜的重复实验误差。

方法细节写在2021年《自然》论文《Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold》。它不是把物理力场逐步积分到天然态，而是从多序列比对里的共进化统计学习几何约束。

数据库的下一步发生在欧洲分子生物学实验室欧洲生物信息研究所（EMBL-EBI）。2022年7月，DeepMind 与 EMBL-EBI 把 AlphaFold 蛋白质结构数据库扩展到覆盖几乎全部已编目的 UniProt 序列。公开声明给出的规模是超过2亿个预测结构。结构生物学的工作前置随之改变：许多课题不再从零搭晶体，而是先看预测，再决定做哪类实验。

2024年诺贝尔化学奖把这件事写成制度记忆。一半授予华盛顿大学的戴维·贝克（David Baker），表彰计算蛋白质设计；另一半共同授予德米斯·哈萨比斯（Demis Hassabis）与江珀，表彰蛋白质结构预测。

预测与设计被放在同一枚奖牌的两面。一个是正问题，一个是逆问题。二者都依赖对能量地貌的有效近似。

未解决的问题#

尽管AlphaFold取得了巨大成功，蛋白质科学中仍有多个未解决的关键问题：

内在无序蛋白（IDPs）：约30-40%的真核生物蛋白质含有较长的无序区域，这些区域不形成固定的三维结构，而是以多种构象的集合体存在。AlphaFold对这些区域的预测置信度较低，因为它们本质上没有单一的"正确答案"。

蛋白质动态与功能：蛋白质不是静态的雕塑。酶的催化活性往往依赖于构象变化，信号转导蛋白需要在多种状态之间切换。理解蛋白质的动态行为需要超越静态结构。

折叠动力学：预测蛋白质如何从展开态折叠到天然态（折叠路径）仍然是一个比预测最终结构更困难的问题。戴维·肖（David E. Shaw）等人2010年在《科学》报告，用专用计算机把小蛋白的结构动力学推进到毫秒量级。那是在力场里看链条怎么走，不是从共进化统计里猜终点。AlphaFold给出的坐标，并不能自动复现这条轨迹。

蛋白质设计：逆向问题——设计具有特定结构和功能的全新蛋白质——正在取得快速进展。David Baker团队（2024年诺贝尔化学奖另一半）开发的RFdiffusion等工具可以从头设计自然界不存在的蛋白质，为药物开发和材料科学开辟了新途径。

约瑟夫·沃森（Joseph L. Watson）等人2023年在《自然》把RFdiffusion写成可公开发表的生成模型：从噪声出发扩散出骨架，再装配侧链。正问题是“这条序列会折成什么”。逆问题是“我要的形状该用哪条序列”。两问共用能量地貌，训练目标却相反。

错误折叠是另一条与预测平行的前线。斯坦利·普鲁西纳（Stanley B. Prusiner）主张某些传染因子没有核酸，只有蛋白质。他称之为朊粒（prion）。1997年诺贝尔生理学或医学奖授予这项工作。

瘙痒病、克雅氏病与牛海绵状脑病的病原，是细胞型朊蛋白被诱导改写成致病构象。序列可以相同，折叠不同，功能与传染性就不同。安芬森图景假定天然态唯一且可及。朊粒表明，另一口能量井也可以被占据，并且可以传播。

神经退行性疾病与若干淀粉样疾病共享“错误折叠并聚集”这一层描述。阿尔茨海默病中的β-淀粉样蛋白与tau、帕金森病中的α-突触核蛋白，并不等于朊粒那种人际传染路径。它们提醒的是同一件物理事实：多肽链可以进入低能的错误聚集态。一张高置信度的静态图，并不能自动告诉你聚集体如何成核。

克里斯托弗·多布森（Christopher M. Dobson）把折叠、错误折叠与人类疾病写成同一张能量图上的不同出口。预测天然态坐标，是堵住其中一个出口。医学真正要管的，往往是另外那些出口何时被打开。

跨域连接#

• 统计力学：莱文塔尔悖论的解法是能量地貌——折叠不是遍历全部构象，而是沿漏斗状地貌一路"滚"向低能态，所以蛋白质能在微秒到秒内完成，而非耗尽宇宙年龄（见正文）。推论：在折叠路径上引入"受挫"（互相冲突的接触）的突变应显著减慢折叠；地貌越平滑，折叠越快。
• 机器学习：AlphaFold 的核心输入是进化信息——多序列比对中协同突变的残基对，在空间上通常彼此靠近（见正文）。推论：序列比对越浅的蛋白预测越差；而内在无序蛋白本就没有唯一答案，低置信度恰恰是正确输出而非失败。
• 阿尔茨海默病：阿尔茨海默病、帕金森病等的共同分子特征是蛋白错误折叠并聚集（见正文）。推论：稳定天然构象、抑制聚集或加速清除聚集物，都应延缓病程——这也解释了针对聚集体的疗法为何成败高度依赖干预时机。
• 蛋白质化学：折叠的驱动力是化学的——疏水效应主导、氢键搭骨架、静电与二硫键锁定细节（见正文）。推论：换溶剂（加变性剂、改 pH）破坏这些相互作用，蛋白就应可预测地去折叠；撤掉变性剂后能否复性，检验"序列决定结构"的适用边界。
• 酶与生物催化：酶的催化本领依赖精确构象，更依赖构象变化——活性位点不是静态雕塑（见正文）。推论：破坏折叠的突变通常直接杀死催化活性；把酶锁定在催化循环某一构象的突变，应按该构象的角色选择性改变活性。

为什么这很重要#

蛋白质折叠是连接基因型和表型的关键环节——DNA中的遗传信息通过蛋白质的三维结构转化为生物功能。理解折叠机制不仅解释了生命的基本运作方式，也为医学（疾病治疗）、农业（作物改良）和工业（酶工程和生物材料）提供了巨大的应用潜力。AlphaFold革命证明，AI可以在基础科学中做出世界级的发现——这预示着计算驱动的科学发现新时代。

中心法则与基因表达把DNA写成蛋白质序列。折叠才把序列写成可以催化、可以信号、可以成结构的物体。没有这一步，基因型到表型的因果链在细胞里是断的。稳定天然态、阻止聚集、或设计自然界没有的折叠，都会改写我们能对活细胞做什么。

AlphaFold证明，规模化的进化数据和深度学习可以在基础科学里给出可公开发表的结构。它没有取消安芬森的热力学问题，也没有取消莱文塔尔的时间问题。它把第三问推进到可以日常使用的程度。其余两问，仍决定药物、材料和细胞能否按意图工作。

参考文献#

1. Jumper, J. et al. (2021). Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature, 596(7873), 583–589.
2. Levinthal, C. (1969). How to fold graciously. Mössbauer Spectroscopy in Biological Systems, 67, 22–24.
3. Dobson, C.M. (2003). Protein folding and misfolding. Nature, 426(6968), 884–890.
4. Anfinsen, C.B. (1973). Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181(4096), 223–230.
5. Baker, D. (2019). What has de novo protein design taught us about protein folding and biophysics? Protein Science, 28(4), 678–683.
6. Wright, P.E. & Dyson, H.J. (1999). Intrinsically unstructured proteins: re-assessing the protein structure-function paradigm. Journal of Molecular Biology, 293(2), 321–331.
7. Shaw, D.E. et al. (2010). Atomic-level characterization of the structural dynamics of proteins. Science, 330(6002), 341–346.
8. Dill, K.A. & Chan, H.S. (1997). From Levinthal to pathways to funnels. Nature Structural Biology, 4(1), 10–19.
9. Dill, K.A. & MacCallum, J.L. (2012). The protein-folding problem, 50 years on. Science, 338(6110), 1042–1044.
10. Prusiner, S.B. (1982). Novel proteinaceous infectious particles cause scrapie. Science, 216(4542), 136–144.
11. Hartl, F.U., Bracher, A. & Hayer-Hartl, M. (2011). Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature, 475(7356), 324–332.
12. Varadi, M. et al. (2022). AlphaFold Protein Structure Database: massively expanding the structural coverage of protein-sequence space with high-accuracy models. Nucleic Acids Research, 50(D1), D439–D444.
13. The Nobel Prize in Chemistry 2024. NobelPrize.org.
14. Watson, J.L. et al. (2023). De novo design of protein structure and function with RFdiffusion. Nature, 620(7976), 1089–1100.