历史上获得过两次诺贝尔奖的人屈指可数，而在同一个领域——化学——拿过两次的，至今只有一个人：弗雷德里克·桑格。
可这个改变了生物学面貌的人，却出了名地低调。他自称不擅长交际、不善演讲，只想躲在实验室里安静地动手做实验。他后来回忆，自己只是"在实验室里瞎折腾"的那类科学家。正是这种近乎执拗的动手钻研，让他先后破解了两个看似不可能的难题：先读出蛋白质的"字母顺序"，再读出 DNA 的"字母顺序"。
破除误解：他读出的不是"一种蛋白质长什么样"，而是"序列本身有意义"
在桑格之前，人们大致知道蛋白质由 20 种氨基酸串成，但普遍以为这些氨基酸的排列大概是随机或没有固定次序的。
桑格证明了一件革命性的事：每一种蛋白质都有一个唯一、精确、固定的氨基酸序列——不多一个、不少一个、顺序丝毫不乱。
他在 1940 年代末选了胰岛素下手——这种由班廷与贝斯特在三十年前分离、用于治疗糖尿病的激素。经过近十年艰苦工作，到 1955 年他完整测出了胰岛素的 51 个氨基酸排列顺序（分布在 A、B 两条肽链上），这是人类第一次读出一个蛋白质完整的"序列"。他还搞清了两条肽链之间是靠二硫键连接的——这正是 dorothy-hodgkin 后来用 X 射线晶体学解出胰岛素三维结构时所依据的化学骨架。
这个突破的深远之处在于：它告诉世界，蛋白质的功能写在它精确的序列里。"序列决定结构、结构决定功能"这条现代分子生物学的中心信条，由此奠基。1958 年，桑格因此获得他的第一个诺贝尔化学奖。
第二座高峰：读出生命的源代码
测完蛋白质，桑格把目光投向了更根本的东西——DNA。如果蛋白质是产品，DNA 就是写着如何制造产品的图纸。能不能把图纸上的字母（A、T、C、G）一个个读出来？
经过多年探索，到 1977 年，桑格和同事发展出双脱氧链终止法（即"桑格测序法"）——一种快速、准确读取长段 DNA 序列的方法。它的巧思在于：故意掺入一些会"卡住"DNA 合成的特殊字母，让链在不同位置随机终止，再按长度排开，就能逐位读出序列。
凭此，1980 年桑格获得他的第二个诺贝尔化学奖，与 Walter Gilbert、Paul Berg 分享。
桑格测序法此后统治了 DNA 测序近三十年，正是它最终读出了完整的人类基因组——2003 年宣告完成的人类基因组计划，其主力技术就建立在桑格的方法之上。可以说，今天整个基因组学、精准医疗的大厦，地基是他打下的。
数字：十年读 51 个字母，三十年后读出 30 亿个
桑格两次得奖，中间隔了二十二年。把两次工作的"读取速度"摆在一起，才看得出这中间发生了什么量级的变化。
第一次：51 个氨基酸，用了大约十年。 胰岛素由两条链组成，A 链 21 个残基、B 链 30 个残基，合计 51 个。桑格与图皮（Hans Tuppy）在 1951 年先攻下 B 链的 30 个残基，A 链的 21 个到 1952 年才完成——A 链更难，因为它内部还有一个链内二硫键在捣乱。完整结构（含二硫键连接方式）到 1955 年才定下来。平均下来，大约每年读出五个氨基酸。
他靠的工具组合非常具体。核心试剂是 FDNB（1-氟-2,4-二硝基苯，后来直接被叫作"桑格试剂"）：它会与肽链游离的 N 端氨基反应，接上一个二硝基苯基。妙处在于这个基团是亮黄色的——被标记的那一端从此在层析纸上肉眼可见。
流程是：用 FDNB 标住 N 端 → 把肽链部分水解成一堆长短不一的片段 → 用当时刚由 Gordon、Martin 与 Synge 引入的分配层析把片段分开 → 完全水解带黄色标记的那个片段，看它释放出哪一个二硝基苯基氨基酸，从而确定该片段的头一个残基 → 换不同的水解条件，得到另一批互相重叠的片段 → 靠重叠部分把顺序拼回去。
这是一件纯粹的手工推理活儿：没有仪器读出序列，序列是从上百个片段的重叠关系里推出来的。
第二次：1977 年的双脱氧链终止法。 这一次读的是 DNA，而且方法可自动化：
| 方法 | 单次可读长度 | 通量 | 每 1000 个碱基的成本 |
|---|---|---|---|
| 手工蛋白测序（1950s） | 约 51 个残基／十年 | — | — |
| 桑格 DNA 测序（1977 起） | 500–800 bp，准确率常 > 99.99% | 一次几十到几百个反应 | 约 500 美元（2011 年前后） |
| 次代测序（2005 起） | 每条读段 50–400 bp | 单次运行数亿条读段 | 不到 0.5 美元 |
注意中间那一栏的取舍：桑格法读得长、准，但一次只能读几十上百个片段；次代测序每条读得又短又稍差，却能同时读几亿条。 人类基因组计划靠的是前者的读长与准确度，此后的大规模测序靠的是后者的通量——两种技术不是替代关系，而是分工。
而最值得记住的一点是：桑格两次突破用的其实是同一个想法。
蛋白测序时，他让肽链在随机位置断开，得到一堆长度不同的片段，再靠长度与重叠关系还原顺序。DNA 测序时，他让新链在随机位置停下（掺入的双脱氧核苷酸缺少 3′-OH，无法再接下一个），得到一堆彼此只差一个碱基的嵌套片段，按长度排开，序列就直接从这把"梯子"上读出来。
"制造受控的随机中断，再按长度排序"——同一个方法论用了两次，各得一次诺贝尔奖。 这也是为什么桑格常被称为"方法学家"而不是理论家：他改变生物学的方式，是让原本读不出来的东西变得可读。
争议与时代：荣誉之外的诚实
桑格的故事里少有戏剧性的争斗，更多是科学本身的曲折。
- "序列"观念的接受：在他证明蛋白质有确定序列之前，学界对此并无共识；他用胰岛素这一个铁证，扭转了整个领域的认识。
- 测序方法的竞争：1980 年的诺奖之所以与 Gilbert 分享，是因为 Maxam 与 Gilbert 同期（1977）发展了另一套化学降解测序法——用二甲基硫酸酯、肼等试剂对特定碱基做部分化学修饰，再在修饰位点切断骨架。两套方法一度并存，但化学法依赖的这些试剂毒性大、步骤难以自动化；桑格法只需一套酶反应加四种双脱氧核苷酸，很快被做成了自动测序仪。"最聪明的方法"未必赢，能被机器重复几百万次的方法往往笑到最后。
- 拒绝封爵：桑格婉拒了爵位，理由是不想被人称作"Sir"。他始终把自己定位为一个普通的实验工作者。
为纪念他，英国设立了桑格研究所（Wellcome Sanger Institute），它在人类基因组计划中承担了最大份额的测序工作——这个名字，成了基因组时代的一个坐标。
跨域连接
- 蛋白质化学：在他之前，蛋白质常被当作组成不定的统计性聚合物。他用二硝基氟苯标记末端残基、再分段水解拼接，测出胰岛素的确定序列——反复测定给出同一答案，本身就是判决性证据：若蛋白质真是随机混合物，每次结果都该不同。蛋白质由此成为可精确书写的信息分子。
- 序列比对：序列一旦成为离散字符串，"两条序列有多像"就变成可计算的问题，动态规划的全局与局部比对算法随之出现。但比对分数里嵌着一套替换代价与空位罚分，也就是嵌着一个进化模型——换一套打分矩阵，"最优"比对就会换一个。算法输出的精确程度，受限于假设的合理程度。
- 分子系统发育：序列让分类摆脱了形态依赖。同源基因间的差异数可当作分歧时间的代理量，亲缘关系于是从相似度判断变成统计推断——这正是核糖体 RNA 测序把古菌从"细菌"里分出来的原因：它们在显微镜下与细菌无异，序列却讲了另一个故事。
- 古 DNA：古代样本中的 DNA 断成几十碱基的短片段并带特征性脱氨损伤，桑格法的长读长在这里派不上用场，必须靠高通量短读长测序加严格的污染控制。结果是人群迁徙这类过去只能从陶器与语言推测的问题，如今由基因组直接裁定——历史学的证据等级被一门化学方法改写了。
- 临床基因组学：测序成本崩塌后，罕见病诊断在技术上已接近查表。真正的瓶颈转移到了解释：每个人携带数以百万计的变异，其中绝大多数落在"意义未明"一栏，因为判定致病性需要功能实验或大样本关联，而这两者都不会随测序一起变便宜。读取能力的增长速度，超过了解读能力。
参考文献
- Sanger, F. & Tuppy, H. "The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin." Biochemical Journal, 49(4), 1951. DOI: 10.1042/bj0490463（胰岛素测序原始论文）
- Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors." Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(12), 1977. DOI: 10.1073/pnas.74.12.5463（桑格测序法原始论文）
- Ryle, A. P., Sanger, F., Smith, L. F. & Kitai, R. "The disulphide bonds of insulin." Biochemical Journal, 60, 1955.
- Maxam, A. M. & Gilbert, W. "A new method for sequencing DNA." Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(2), 1977. DOI: 10.1073/pnas.74.2.560
- Shendure, J. & Ji, H. "Next-generation DNA sequencing." Nature Biotechnology, 26, 2008. DOI: 10.1038/nbt1486
- García-Sancho, M. Biology, Computing, and the History of Molecular Sequencing, Palgrave Macmillan, 2012.
延伸阅读
- The Royal Swedish Academy of Sciences. "The Nobel Prize in Chemistry 1958 & 1980 — Frederick Sanger." Nobel Foundation.
- Brownlee, G. G. Fred Sanger – Double Nobel Laureate: A Biography, Cambridge University Press, 2014.