弗雷德里克·桑格

破除误解：他读出的不是"一种蛋白质长什么样"，而是"序列本身有意义"#

在桑格之前，人们大致知道蛋白质由 20 种氨基酸串成，但普遍以为这些氨基酸的排列大概是随机或没有固定次序的。

桑格证明了一件革命性的事：每一种蛋白质都有一个唯一、精确、固定的氨基酸序列——不多一个、不少一个、顺序丝毫不乱。

他在 1940 年代末选了胰岛素下手——这种由班廷与贝斯特在三十年前分离、用于治疗糖尿病的激素。经过近十年艰苦工作，到 1955 年他完整测出了胰岛素的 51 个氨基酸排列顺序（分布在 A、B 两条肽链上），这是人类第一次读出一个蛋白质完整的"序列"。他还搞清了两条肽链之间是靠二硫键连接的——这正是 dorothy-hodgkin 后来用 X 射线晶体学解出胰岛素三维结构时所依据的化学骨架。

这个突破的深远之处在于：它告诉世界，蛋白质的功能写在它精确的序列里。"序列决定结构、结构决定功能"这条现代分子生物学的中心信条，由此奠基。1958 年，桑格因此获得他的第一个诺贝尔化学奖。

这里的「序列」不是化学家口头上的组成清单。胰岛素的元素分析早就告诉人们它含哪些氨基酸、大概各有多少；缺的是次序。次序一旦固定，蛋白质就不再是一袋配好比例的原料，而变成一条可以抄写、可以突变、也可以传下去的信息。桑格用一个分子证明：生命在这个层次上是离散字符串，不是连续的浆。

在一九五八年前后，克里克把这件事写成「序列假说」：一段核苷酸序列决定一段氨基酸序列，后者再决定蛋白质如何折叠、如何工作。当时这仍是纲领。桑格的胰岛素把纲领变成了可以核对的对象——同一来源的分子给出同一条链，换一种水解条件仍然拼回同一条链。若蛋白质只是统计混合物，这种重复本身不会发生。

「结构决定功能」后来常被说成一句口号。对胰岛素这样的小蛋白，次序先把化学骨架钉死，三维折叠才有一张可以对照的图纸。霍奇金后来解出的晶体结构，用的正是这张已经写好的一维文本，而不是从电子密度里凭空猜残基顺序。

安芬森把同一判断推到折叠：对许多小蛋白，氨基酸次序已经包含三维结构的信息。这不是桑格的实验，却是「序列本身有意义」在结构化学里的下一句。桑格提供可读的一维文本，安芬森问文本够不够决定折叠；两句话连起来，才把蛋白质从组成分析推进到信息分子。

第二座高峰：读出生命的源代码#

测完蛋白质，桑格把目光投向了更根本的东西——DNA。如果蛋白质是产品，DNA 就是写着如何制造产品的图纸。能不能把图纸上的字母（A、T、C、G）一个个读出来？

经过多年探索，到 1977 年，桑格和同事发展出双脱氧链终止法（即"桑格测序法"）——一种快速、准确读取长段 DNA 序列的方法。它的巧思在于：故意掺入一些会"卡住"DNA 合成的特殊字母，让链在不同位置随机终止，再按长度排开，就能逐位读出序列。

凭此，1980 年桑格获得他的第二个诺贝尔化学奖，与 Walter Gilbert、Paul Berg 分享。

桑格测序法此后统治了 DNA 测序近三十年，正是它最终读出了完整的人类基因组——2003 年宣告完成的人类基因组计划，其主力技术就建立在桑格的方法之上。可以说，今天整个基因组学、精准医疗的大厦，地基是他打下的。

从蛋白质到 DNA，他并没有改主意，只是把「序列本身有意义」这句话推到了更上游。蛋白质序列解释这一只分子为什么这样工作；DNA 序列解释细胞为什么会制造这一只分子、而不是另一只。字母从二十种氨基酸换成四种碱基，信息的载体变了，但「次序即意义」没有变。DNA与遗传 后来讲的中心法则，缺的正是把图纸上的字母读出来的能力。

不要把一九七七年的突破理解成一份按步骤执行的实验协议。双脱氧链终止法的要点不是试剂表，而是它第一次让 DNA 的次序成为实验室里的常规读数：读长足够覆盖基因，误差低到可以当文本用。人类基因组计划把它放大成工业，地基仍是「序列是一种文本」这个判断。操作细则会换，文本这个地位没有换。

数字：十年读 51 个字母，三十年后读出 30 亿个#

桑格两次得奖，中间隔了二十二年。把两次工作的"读取速度"摆在一起，才看得出这中间发生了什么量级的变化。

第一次：51 个氨基酸，用了大约十年。 胰岛素由两条链组成，A 链 21 个残基、B 链 30 个残基，合计 51 个。桑格与图皮（Hans Tuppy）在 1951 年先攻下 B 链的 30 个残基，A 链的 21 个到 1952 年才完成——A 链更难，因为它内部还有一个链内二硫键在捣乱。完整结构（含二硫键连接方式）到 1955 年才定下来。平均下来，大约每年读出五个氨基酸。

他靠的工具组合非常具体。核心试剂是 FDNB（1-氟-2,4-二硝基苯，后来直接被叫作"桑格试剂"）：它会与肽链游离的 N 端氨基反应，接上一个二硝基苯基。妙处在于这个基团是亮黄色的——被标记的那一端从此在层析纸上肉眼可见。

流程是：用 FDNB 标住 N 端 → 把肽链部分水解成一堆长短不一的片段 → 用当时刚由 Gordon、Martin 与 Synge 引入的分配层析把片段分开 → 完全水解带黄色标记的那个片段，看它释放出哪一个二硝基苯基氨基酸，从而确定该片段的头一个残基 → 换不同的水解条件，得到另一批互相重叠的片段 → 靠重叠部分把顺序拼回去。

这是一件纯粹的手工推理活儿：没有仪器读出序列，序列是从上百个片段的重叠关系里推出来的。

第二次：1977 年的双脱氧链终止法。 这一次读的是 DNA，而且方法可自动化：

注意中间那一栏的取舍：桑格法读得长、准，但一次只能读几十上百个片段；次代测序每条读得又短又稍差，却能同时读几亿条。 人类基因组计划靠的是前者的读长与准确度，此后的大规模测序靠的是后者的通量——两种技术不是替代关系，而是分工。

而最值得记住的一点是：桑格两次突破用的其实是同一个想法。

蛋白测序时，他让肽链在随机位置断开，得到一堆长度不同的片段，再靠长度与重叠关系还原顺序。DNA 测序时，他让新链在随机位置停下（掺入的双脱氧核苷酸缺少 3′-OH，无法再接下一个），得到一堆彼此只差一个碱基的嵌套片段，按长度排开，序列就直接从这把"梯子"上读出来。

"制造受控的随机中断，再按长度排序"——同一个方法论用了两次，各得一次诺贝尔奖。 这也是为什么桑格常被称为"方法学家"而不是理论家：他改变生物学的方式，是让原本读不出来的东西变得可读。

两次读取的对象不同，意义的层次却是同一件事。蛋白质序列回答「这个分子是谁」；DNA 序列回答「谁有权决定这个分子是谁」。中间隔了中心法则所要求的那次翻译：核酸上的三联体被映射成氨基酸。

桑格并不需要先发明遗传密码，他需要的是证明两头的字符串都真实存在、都可以被读出来。没有第一头，结构生物学只剩晶体里的电子密度；没有第二头，遗传学只剩杂交与表型。

通量后来爆炸，是因为「文本」这个隐喻被机器接受了。一旦序列是字符串，它就可以被存储、比对、检索，也可以被错误地当成说明书的全文——而基因组里大部分字母并不编码蛋白质。桑格打开的是可读性，不是「每个碱基都有一个已知功能」的保证。后面这一点，要到大规模测序之后才变成日常的解释危机。

争议与时代：荣誉之外的诚实#

桑格的故事里少有戏剧性的争斗，更多是科学本身的曲折。

• "序列"观念的接受：在他证明蛋白质有确定序列之前，学界对此并无共识；他用胰岛素这一个铁证，扭转了整个领域的认识。
• 测序方法的竞争：1980 年的诺奖之所以与 Gilbert 分享，是因为 Maxam 与 Gilbert 同期（1977）发展了另一套化学降解测序法——用二甲基硫酸酯、肼等试剂对特定碱基做部分化学修饰，再在修饰位点切断骨架。两套方法一度并存，但化学法依赖的这些试剂毒性大、步骤难以自动化；桑格法只需一套酶反应加四种双脱氧核苷酸，很快被做成了自动测序仪。"最聪明的方法"未必赢，能被机器重复几百万次的方法往往笑到最后。
• 拒绝封爵：桑格婉拒了爵位，理由是不想被人称作"Sir"。他始终把自己定位为一个普通的实验工作者。

为纪念他，英国设立了桑格研究所（Wellcome Sanger Institute），它在人类基因组计划中承担了最大份额的测序工作——这个名字，成了基因组时代的一个坐标。

「序列有意义」后来也被说过头。它成立的范围是：对一条确定的多肽，次序决定它在给定环境下倾向于怎样折叠；对一段编码区，次序约束它能被翻译成哪条多肽。它不成立的范围是：把基因组每一个碱基都当成已经写好的命运。

桑格自己很少做这种跳跃。他提供的是读取能力，解释工作被留给遗传学、医学和后来的计算生物学。

两次诺奖隔了二十二年，中间生物学的中心已经从「纯物质的化学」滑向「带文本的化学」。第一次得奖时，人们还在争论蛋白质有没有固定序列；第二次得奖时，争论变成了如何把文本读得足够长、足够便宜。方法换了，那句关于次序的判断没有换。

研究所用他的名字，不是因为他留下了一份可以在课堂上逐步演示的测序配方。配方早已被毛细管电泳、染料终止和后来的高通量平台改写。留下来的是一种学科直觉：先把生命写成可以核对的字符串，再讨论字符串是什么意思。没有这一步，后面的基因组学只是更快的染色。

跨域连接#

• 蛋白质化学：在他之前，蛋白质常被当作组成不定的统计性聚合物。他用二硝基氟苯标记末端残基、再分段水解拼接，测出胰岛素的确定序列——反复测定给出同一答案，本身就是判决性证据：若蛋白质真是随机混合物，每次结果都该不同。蛋白质由此成为可精确书写的信息分子。
• 序列比对：序列一旦成为离散字符串，"两条序列有多像"就变成可计算的问题，动态规划的全局与局部比对算法随之出现。但比对分数里嵌着一套替换代价与空位罚分，也就是嵌着一个进化模型——换一套打分矩阵，"最优"比对就会换一个。算法输出的精确程度，受限于假设的合理程度。
• 分子系统发育：序列让分类摆脱了形态依赖。同源基因间的差异数可当作分歧时间的代理量，亲缘关系于是从相似度判断变成统计推断——这正是核糖体 RNA 测序把古菌从"细菌"里分出来的原因：它们在显微镜下与细菌无异，序列却讲了另一个故事。
• 古 DNA：古代样本中的 DNA 断成几十碱基的短片段并带特征性脱氨损伤，桑格法的长读长在这里派不上用场，必须靠高通量短读长测序加严格的污染控制。结果是人群迁徙这类过去只能从陶器与语言推测的问题，如今由基因组直接裁定——历史学的证据等级被一门化学方法改写了。
• 临床基因组学：测序成本崩塌后，罕见病诊断在技术上已接近查表。真正的瓶颈转移到了解释：每个人携带数以百万计的变异，其中绝大多数落在"意义未明"一栏，因为判定致病性需要功能实验或大样本关联，而这两者都不会随测序一起变便宜。读取能力的增长速度，超过了解读能力。

参考文献#

• Sanger, F. & Tuppy, H. "The amino-acid sequence in the phenylalanyl chain of insulin." Biochemical Journal, 49(4), 1951. DOI: 10.1042/bj0490463（胰岛素测序原始论文）
• Sanger, F., Nicklen, S. & Coulson, A. R. "DNA sequencing with chain-terminating inhibitors." Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(12), 1977. DOI: 10.1073/pnas.74.12.5463（桑格测序法原始论文）
• Ryle, A. P., Sanger, F., Smith, L. F. & Kitai, R. "The disulphide bonds of insulin." Biochemical Journal, 60, 1955.
• Maxam, A. M. & Gilbert, W. "A new method for sequencing DNA." Proceedings of the National Academy of Sciences, 74(2), 1977. DOI: 10.1073/pnas.74.2.560
• Shendure, J. & Ji, H. "Next-generation DNA sequencing." Nature Biotechnology, 26, 2008. DOI: 10.1038/nbt1486
• García-Sancho, M. Biology, Computing, and the History of Molecular Sequencing, Palgrave Macmillan, 2012.
• Crick, F. H. C. (1958). On protein synthesis. Symposia of the Society for Experimental Biology, 12, 138–163.
• Anfinsen, C. B. (1973). Principles that govern the folding of protein chains. Science, 181, 223–230.
• Sanger, F. (1988). Sequences, sequences, and sequences. Annual Review of Biochemistry, 57, 1–28.

延伸阅读#

• The Royal Swedish Academy of Sciences. "The Nobel Prize in Chemistry 1958 & 1980 — Frederick Sanger." Nobel Foundation.
• Brownlee, G. G. Fred Sanger – Double Nobel Laureate: A Biography, Cambridge University Press, 2014.